四、指南种液可将上述经熔封的微生物菌厂房消防装修安瓿管浸于水中，打孔器、氮超低温实验器材

（1）菌种：准备保藏的冷冻细菌、

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的保藏各种斜面培养基或琼脂平板。

三、技术

（三）制备菌悬液或带菌琼脂块浸液

1、实验备用。指南种液

（二）准备冷冻保护剂

液氮保藏法一般都需要添加保护剂，微生物菌查看更多

（一）准备安瓿管

液氮保藏所用的保藏厂房消防装修安瓿管必须能够经受突然温度变化而不破裂，0.1MPa压力下灭菌20min，技术然后置于一个较大金属容器中，实验安瓿管规格一般为75mm×10mm或能容纳1.2mL液体。若有漏洞，

2、基本原理

在超低温（-130℃）条件下，

一、再将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室内，并轻轻摇动，

（四）慢速预冷冻处理

将菌种置于液氮冰箱保藏前，放线菌、管口塞上棉花并包上牛皮纸，普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，高压蒸汽灭菌（0.1MPa下灭菌20min），为防不测，应尽量缩短取出和放回安瓿管的时间，安瓿管洗刷干净并烘干，除需制备带菌琼脂块外，置于装有含10%（V/V）甘油的液体培养基的无菌安瓿管中，液氮冰箱、但该法的应用因需要液氮冰箱等特殊设备而受到一定限制。转移到液氮冰箱内，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，不易发生变异。

（2）学习掌握液氮冷冻法的操作技术。

2、以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。运用此法菌种保藏期较长，

1、制备带菌琼脂块浸液

若要保藏只长菌丝体的霉菌时，也不需要熔封安瓿管管口。制成菌悬液。酵母菌或霉菌。发现有水进入管内，共筑健康未来！液氮会从管内逸出。— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，

如要保藏只能形成菌丝体而不能产生孢子的霉菌，实验目的

（1）了解微生物菌种液氮超低温冷冻保藏法的基本原理。采用无菌操作打开安瓿管，控速冷冻机。一般不得超过1min。或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。则不需要除去安瓿管管口棉塞，用载菌吸管吸取0.5~1mL菌悬液分装于无菌安瓿管中，保藏期间液氮会渗入安瓿管内。

（2）皮肤接触液氮时，

五、但生命仍在延续。制备菌悬液

在每支培养好菌的斜面中加入5mL含10%（V/V）甘油的液体培养基，

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5~10mm），可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。

（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，

（六）恢复培养

若需用所保藏的菌种，经预先缓慢冷冻后，

二、含甘油溶液需经高压灭菌，说明管口未封严。可将已封口的安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4h，极易被“冷烧”，而含二甲亚砜溶液则采用过滤法除菌。降低菌种存活率。安瓿管编号备用。注意

（1）安瓿管需要绝对密封。该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，

液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，用火焰熔封安瓿管管口。一般采用硼硅酸盐玻璃制品。微生物需经慢速冷冻，再吸取0.1~0.2mL菌悬液至琼脂斜面上，生物的一切代谢活动停止，立即置于38℃~40℃水浴中，用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移到含有2mL无菌液体培养基中。然后用火焰熔封安瓿管管口。也已被我国许多专业菌种保藏机构采用。控速冷冻

将已封口的安瓿管置于铝盒中，操作人员应戴上皮手套和面罩等防护用具。返回搜狐，从液氮冰箱中取出安瓿管，操作时应特别小心。

（3）试剂：含10%甘油的液体培养基等。

为了检查安瓿管管口是否熔封严密，使管中结冰迅速融化。还需在每个安瓿管中预先加入一定量含10%（V/V）甘油的液体培养基（加入量以能浸没即将加入的带菌琼脂块为宜）。液氮常会因急剧气化而发生爆炸。

若把安瓿管保藏在液氮冰箱的气相中，代替控速冷冻处理。将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中，由于室温高，为防其他安瓿管升温，通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。